蛋白質提取檢測試劑適用于測定蛋白濃度在20-5000μg/ml樣品。測定前取1-2個樣做預實驗,若A測定管-A空白管﹥1.5,需將樣本用提取液稀釋后再測定,以確保測定的準確性。大部分蛋白質都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液,少數與脂類結合的蛋白質則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機溶劑中,因些,可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質及酶。由于蛋白質中存在著含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸,因此蛋白質具有吸收紫外光的性質,大吸收峰在280nm波長處。在此波長范圍內,蛋白質溶液的光密度OD280nm與其濃度呈正比關系,可作定量測定。 自備實驗用品及儀器:
臺式離心機、恒溫水浴鍋、可見分光光度計、移液器、1mL玻璃比色皿和蒸餾水。試劑組成和配制:
試劑A:液體50mL×1瓶,4℃保存。試劑B:液體1mL×1支,4℃保存。標準蛋白:液體2mL×1支,4℃保存。
工作液配制:臨用前請根據擬用工作液體積(樣本數×1mL),將試劑A和B按照50:1的比例混合,蓋緊后充分混勻。樣品中可溶性蛋白質提取:
1.液體樣品:澄清無色液體樣品可以直接測定。2.組織樣品:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液(自備),根據需要選用酶提取緩沖液或者蒸餾水或者生理鹽水)冰浴勻漿,8000g,4℃離心10min,取上清,即待測液。3.細菌、細胞:按照細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后8000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。測定操作:
1.分光光度計預熱30min,調節波長到562?nm,蒸餾水調零。2.工作液置于60℃水浴預熱30min。