1) 總RNA提取
2) 已知序列的驗證:根據(jù)客戶提供的已知序列設(shè)計引物,以總RNA為模板進行RT-PCR擴增,驗證參考序列的存在及方向。
3) 5’和3’RACE
a) RNA的去磷酸化處理
b) RNA的3’末端處理;RNA的5’末端處理
c) cDNA的合成
d) 5’和3’RACE的PCR反應(yīng)
e) PCR產(chǎn)物構(gòu)建TA克隆
f) 分別隨機挑取10個克隆進行測序
4) 對獲取的序列進行驗證以驗證獲取的5' RACE或3' RACE序列與已知序列是否連續(xù)存在于同一條cDNA片段上。
客戶提供
總RNA量大于10 mg,如果基因的豐度較低或者未知序列較長,請?zhí)峁┍M量多的實驗材料。
已知的參考序列長度≥200 bp。
我們提供
構(gòu)建好5’和3’RACE的TA克隆(含20%甘油的LB培養(yǎng)基),裝到PMD18-T載體上;測序圖譜;實驗報告
質(zhì)量保證
獲取的5' RACE或3' RACE序列與已知序列連續(xù)存在于同一條cDNA片段上